产品简介 StarLighter Probe qPCR Kit for Blood 是一款针对血液样本进行简单裂解便可实现理想的 qPCR 扩增的试剂盒，操作简便且检测结果与传统提纯的核酸样本的检测效果一致，本试剂盒包含血液样本裂解液及 2 × qPCR 预混液。 本产品的血液裂解液中添加有细胞膜裂解剂、蛋白变性剂、核酸酶抑制剂等成分，使用时只需将裂解液与血液等比例混合、加热、离心，取上清做模板即可，配合专门研发的耐受血液的缓冲体系，在抑制非特异扩增的同时，针对不同模板 GC 含量、不同引物/探针 Tm 值均可实现特异且高灵敏的扩增。本产品可用于新鲜、4℃ 储存或 -20℃ 冻存的 EDTA 抗凝血的检测，适用于 SNP 基因分型检测，qPCR探针法定量及检测等。 产品组分 组分名称 | FS-Q9001-S（1 mL） | FS-Q9001-01（5 mL） | 2 × StarLighter Probe qPCR Mix For Blood | 1 mL | 5 mL | 50 × StarLighter ROX High | 40 μL | 200 μL | 50 × StarLighter ROX Low | 40 μL | 200 μL | StarLighter Blood DNA Release Buffer | 7.5 mL | 38 mL |
注：请按照推荐的储存温度保存，避免反复冻融。 储存及运输条件 -25 ~ -15℃ 保存，< 0℃ 运输。 产品应用 血液样本核酸释放； SNP 和等位基因分型； qPCR 探针法定量检测。 注意事项 - 使用前请务必确保产品完全融化并充分混匀。
- 为方便使用，StarLighter Blood DNA Release Buffer也可 2-8℃ 保存。
- 使用适当的引物设计软件来设计引物，并使其熔解温度在60℃ 左右，以更好利用两步法的循环程序。
- 根据不同仪器选择适配的ROX。
仪器与ROX参比染料对照表： 仪器 | ROX 参比染料 | Applied Biosystems® 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT, StepOne™, and StepOnePlus™ | ROX High | Applied Biosystems® 7500, ViiA™ 7, QuantStudio™ 12K Flex, Agilent Mx3000P™, Mx3005P™, and Mx4000™ | ROX Low | Rotor-Gene™, DNA Engine Opticon™, Opticon™ 2, Chromo 4™ Real-Time Detector, Mastercycler® ep realplex, Smart Cycler®, Roche LightCycler® 480, Roche LightCycler® Nano, Bio-Rad CFX96, and Illumina Eco™ | No ROX |
实验流程 - 血液样本处理
- 取75 μL血液到 5 mL 离心管，加入 75 μL StarLighter Blood DNA Release Buffer（使用前若有结晶析出需室温平衡或加热助溶至溶解），涡旋混匀并瞬时离心，然后将离心管放于金属浴 95℃ 加热 5 min；
- 加热结束后，取出离心管，12,000 rpm离心 2 min（或 4,000 rpm 低速离心10 min），取出上清做模板备用，注意取上清时勿吸到离心管壁/底部沉淀物；
注：一般离心后上清的体积约是加入血液体积的 70% ~ 100%，建议后续的 qPCR 反应中模板添加量占总反应体系的10% ~ 20%，须搭配启衡星2× StarLighter Probe qPCR Mix For Blood进行扩增。 - 扩增反应体系配制
- 配制前，确保所有组分充分混匀；
- 按照下表配制反应体系：
组分名称 | 加样体积 | 2 × StarLighter Probe qPCR Mix For Blood | 10 μL | Forward Primer（10 μM ） | 0.4 μL | Reverse Primer（10 μM） | 0.4 μL | Probe（10 μM） | 0.4 μL | Template | As Required（推荐2 μL） | 50 × ROX Low/High | 0.4 μL | ddH2O | 补至 20 μL |
- 反应体系可以在5 ~ 25 μL 范围调整（各组分按比例变化），不建议 >50 μL。
- 引物和探针反应终浓度可以在1 ~ 1 μM 之间调整。
- 使用时共同组分最好先配成预混液。
- ROX根据机型使用。
- 反应程序
qPCR 标准程序 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 预变性 | 95℃ | 2 min | 1 cycle | 变性 | 95℃ | 10 sec | 40 ~ 45 cycle | 退火/延伸/数据采集 | 60℃ | 30 sec |
- 预变性时间设置在30 sec ~ 5 min，若模板 GC 含量较高可适当延长预变性时间至 5 min。
- 变性时间：标准程序选择10 sec，快速程序可以选择 3 ~ 10 sec。
- 退火/延伸温度需要依据引物和探针Tm 值确定，一般 50 ~ 65℃，初次可使用 60℃ 做预实验。
- 退火/延伸时间根据扩增片段长度可在20 ~ 45 sec 之间调整。
常见问题与解决方法 - 扩增曲线异常的原因及解决办法是什么？
答：①如果扩增曲线不光滑，则需要重新校正系统，提高模板浓度，检查 ROX 是否使用错误。 ②如果扩增曲线出现断裂或下滑，则可能是模板浓度过高或基线选取范围不当导致，可以降低模板或重新设置基线。 ③如果个别扩增曲线骤降，则可能是反应管有气泡，所以上机前应先离心。 - 如果反应结束无扩增曲线怎么办？
答：①可能是循环数不够：一般设 40 个循环，但过多循环数会增加背景信号，降低数据可信度。 ②确认程序中是否设置信号采集：两步法一般在退火/延伸阶段采集信号；三步法在延伸阶段采集信号。 ③引物降解：PAGE 检测排除其降解的可能性。 ④模板浓度太低：减少稀释度重复实验，先从高浓度做起。 ⑤模板降解：重新制备模板。 - Ct值太高怎么办？
答：①扩增效率低：优化反应条件，尝试三步法扩增或重新设计合成引物。 ②模板浓度低：减少模板稀释度，先从高浓度做起。 ③模板降解：重新制备模板。 ④PCR 产物太长：推荐 PCR 产物长度 80 ~ 150 bp。 ⑤存在PCR抑制剂：若为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备模板。 - 阴性对照出现明显扩增怎么办？
答：①反应体系污染：更换新的试剂、水、引物等重复实验；在超净工作台内操作，减少气溶胶污染。 ②引物设计不合理：重新设计并合成引物。 - 标准曲线线性关系不佳怎么办？
答：①加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。 ②标准品降解：重新制备标准品。 ③模板浓度太高：提高模板稀释倍数。 - 实验重复性差怎么办？
答：①加样体积不一致：使用更好的移液器；将模板做高倍稀释，适当提高加样体积。 ②模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。 |
