CUT&Tag技术服务

  Cleavage Under Target & Tagmentation (CUT&Tag) 是近年来新兴的一种染色质 DNA 结合图谱测序研究方法。该方法通过 Protein A/G 融合的 Tn5 转座酶与抗体结合，使 Tn5 转座酶被募集在靶标位点附近，从而在靶标位点引发 DNA 转座反应，在将染色质 DNA 切断的同时，引入二代测序所需的接头序列。CUT&Tag 技术相比于经典的 ChIP-seq 技术，具有不需要超声打断，信噪比高，所需细胞量少的优势。此外，相比于另一种新技术 Cleavage Under Target And Release Using Nuclease (CUT&RUN)，CUT&Tag 不需要传统的连接法添加测序接头，操作简单、实验周期更短。因此，CUT&Tag在组蛋白修饰、转录因子的染色质结合状态的研究中得到了广泛的应用。启衡星生物 CUT&Tag 技术服务适用于哺乳动物细胞系样本、临床组织样本，以及经过处理的植物和酵母细胞样本。

二、技术原理

将特异的抗体（如转录因子）与染色质蛋白原位结合，然后锚定到 A-Tn5 转座融合蛋白。Tn5 转座酶活性被激活，仅将抗体靶蛋白结合的染色质片段化，高效产生高分辨率、低背景的片段文库。

CUT&Tag 技术原理：一抗染色质上的目的蛋白结合，二抗与一抗结合，随后 A-Tn5 转座体与抗体结合； 激活转座体，将目的蛋白结合的DNA片段化。

CUT&Tag技术目前已经广泛应用于组蛋白修饰/染色质结合蛋白分析、开放染色质分析、单细胞组学、DNA甲基化分析、空间生物学和染色质构象捕获 (3C)等多种研究方向，并且适用于植物和动物的多种模式物种。

• H3K27ac：绘制增强子图谱，鉴定超级增强子目录。
• H3K4me3：检测转录起始位点附近激活的启动子区域
• 组蛋白乳酸化修饰：在基因启动子上高度富集，与 Warburg效应相关的血管生成、缺氧、巨噬细胞极化过程相关基因的活跃表达有关。
• 组蛋白巴豆酰化修饰：与活跃转录和基因激活密切相关，调控着基因表达及配子成熟等生物学过程。此外，组蛋白巴豆酰化修饰的蛋白参与了 RNA 剪接、蛋白质合成降解、DNA复制和修复、内吞作用、细胞间连接等多种生物学过程。
• DNA G4 链体：通常位于基因启动子区域、5' 非翻译区和染色体端粒，能够影响这些区域的 DNA 复制、转录和稳定性。例如，G4 结构的形成可以作为一种调节机制，通过阻碍或促进转录因子的结合来调节特定基因的表达，与多种疾病的发展有关，如癌症、神经退行性疾病等。更多转录因子：挖掘蛋白质 -DNA 相互作用。

• 基本分析

1. 基因组比对分析
2. 富集区域基本信息
3. 富集区域分布特征
4. Peak 相关基因 GO 分析
5. Peak 相关基因 KEGG 分析
6. 差异 Peak 相关基因 GO，KEGG 分析
7. 富集区域 motif 分析

• 高级分析

1. 超级增强子分析（H3K27ac 抗体、BRD4 抗体）
2. 合并抗体富集热图
3. GO KEGG 圈图
4. IGV 峰图 ( 附 5 个基因 )

1. 样本量仅需 20 万个细胞，从百万级降低到单细胞水平
2. 操作便捷，一管完成所有步骤
3. 结果重复性好，且信噪比较高
4. 简化了文库构建流程，在转座子上添加了‘接头’，只需要简单的PCR即可获得高质量NGS文库

• 项目周期：最快2周
• 服务价格：根据不同的要求进行试验设计，具体价格欢迎致电咨询/扫码咨询
• 服务流程：样品预处理→寄送样品与抗体（部分地区可上门取样）→样品检测→实验建库→高通量测序→生信分析→结果交付

• 实测数据展示

样本要求：

• 为确保项目顺利进行，每个样本准备 2 份，单独分装于冻存管中（请自行分装成 2 份，避免分 样过程造成样本损失或降解），一份为实验样本，一份为备份样本，备份样本名称+“备份”；
• 强烈建议实验设计有技术/生物学重复；
• 样本名称命名规则为：长度度<9个字符的命名，只允许英文字母与数字的组合形式，样本名称用于结果数据图表展示；样本名称须与管上名称保持一致，如不一致则将管上标记写在样本信息单备注栏；
• 细胞冻存管/EP管样本点清样本数量，核对样本名称，将样本管放置自封袋，避免遗落；
• 活细胞（新鲜细胞）请提前1天联系销售业务员/经理，避免因临时因素影响样本/实验质量；
• 干冰用量需充足，不同区域的干冰用量可参考附录，建议使用大于4 cm厚度的泡沫箱。
• 样本> 30万细胞，信息单请备注细胞数量；> 100 mg 组织。

1.活细胞（新鲜细胞）

1.1 贴壁细胞：

• 推荐 方法1）每份样本1个T25细胞培养瓶，提前接种，选择生长良好的细胞，以生长1/3～1/2瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液，加满，拧紧瓶盖，用封口膜 密封紧瓶盖边缘，标记好样本名称，培养瓶用缓冲物包裹（棉花包裹，减少运输过程的振动），放入6-8个冰袋（冰袋不直接接触培养皿），填充缓冲物包裹紧实；泡沫箱封箱寄出。由实验室进行消化，默认用胰蛋白酶消化2~5min，特殊情况请备注消化时间、注意事项；
• 方法2）胰酶消化好，培养基重悬细胞，转移至15 mL离心管运输。请备注：胰酶消化的贴壁细胞。

1.2 悬浮细胞：

选择生长良好的细胞，离心去掉旧培养液，补充新的培养液，装满离心管，用封口膜密封紧瓶盖边缘，标记好样本名称，用防震材料包裹离心管，冰袋运输。

对于活细胞，在样本到达目的地实验室后，立即进行CUT&Tag建库。

温馨提示：在样本到达前请至少提前1天和销售业务员/经理沟通，并安排好样本制备计划，保证样本在下午2点前送到。运输标签上应注明“易碎品”、“切勿冷冻”等字样。

2. 冻存细胞

2.1 贴壁细胞冻存

1）取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞状态，确定生长状态良好。去除旧培养液，用 1XPBS 清洗（Mg2+和 Ca2+会影响 Tn5 酶的效率，建议使用不含 Mg²⁺和 Ca²⁺的 PBS， 即 DPBS）；

2）去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

3）加入等体积的完全培养基（含血清的完全培养基）终止胰酶的消化反应，轻轻吹打混匀 后转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min，去上清；

4）用1ml预先配制的细胞冻存液重悬细胞，轻轻吹打使细胞均匀，计数；根据细胞类型 调整细胞密度(一般为1×10⁶ cells/ml或更高)；

5）分装入冻存管，每个冻存管分装1 ml；

6）将冻存管放置于程序降温盒中（梯度降温原则），放入-80℃冰箱中保存，24 h以后转移至液氮，长期保存，干冰运输。

2.2 悬浮细胞冻存

1）取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞状态，确定生长状态良好；

2）1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀；加入PBS，轻轻吹打混匀；

3）1000 rpm离心5 min，去上清；

4）用1 ml预先配制的细胞冻存液重悬细胞，轻轻吹打使细胞均匀，计数；根据细胞类型 调整细胞密度(一般为1×10⁶ cells/ml或更高)；

5）分装入冻存管，每个冻存管分装1ml；

6）将冻存管放置于程序降温盒中（梯度降温原则），放入-80℃冰箱中保存，24 h以后转移至液氮，长期保存，干冰运输。

细胞培养小贴士：1. 使用专门用于液氮冻存的细胞冻存管，而普通的离心管在后续解冻时，易发生爆裂； 2. DMSO配制的时候会放热，等冻存液冷却后使用；3. 程序降温盒需恢复到室温以后才能用于梯度降温冻存；4. 细胞离心后尽量吸干净上清液，避免造成对细胞冻存液的稀释；5. 加入细胞冻存液以后尽 量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞有损伤，立即转入程序降温盒放到-80℃冰箱，不可放4℃； 转移过程中，注意避免产生温差或冻存管融化，适当的时候用干冰（液氮与-80℃冰箱距离较远）转移；6. 尽量不能直接用手拿含有细胞悬液的冻存管，或者冻存管中部，避免融化；7. 如没有液氮条件，请将冻存 细胞置于-80℃冰箱靠近里面，减少开门引起温度变化的影响；8. 建议细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率；

3. 组织
温馨提示：

（1）准备好细胞冻存管（推荐2 ml规格外旋盖），使用耐受有机溶剂的marker笔标上样本名称、冻存时间；一个样本对应多份绿豆大小组织的，样本名称后添加“-a-b–c …”依次类推；每管加 入1ml组织保存液，组织保存液可以自行购买（例如MACS®TissueStorageSolution），或提前联系实验室寄送；（2）组织状态良好；（3）样本处理过程应在冰上快速进行；（4）4℃预冷PBS溶液、 组织保存液。

推荐）方法1：组织保存液；

1）取样活组织，立即剔除脂肪、结缔组织等杂质；

2）转移至新的离心管中，用预冷的PBS溶液（Mg²⁺和 Ca²⁺会影响 Tn5 酶的效率，建议 使用不含 Mg²⁺和 Ca²⁺的 PBS，即 DPBS）将组织表面残留的血液冲洗干净；

3）体积大的组织需切成绿豆大小（2.5-3 mm），每份绿豆大小的组织用无尘纸迅速吸干水分，每份绿豆大小的组织对应1管1 ml组织保存液，立即置于事先准备好的含有1 ml 组织保存液的细胞冻存管；

4）4℃短暂保存，立即2℃~8℃冷链运输，24 h到达实验室（不超过48 h）；

方法2：液氮速冻，干冰运输；

1）取样活组织，立即剔除脂肪、结缔组织等杂质；

2）转移至新的离心管中，用预冷的PBS溶液（Mg²⁺和 Ca²⁺会影响 Tn5 酶的效率，建议 使用不含 Mg²⁺和 Ca²⁺的 PBS，即 DPBS）将组织表面残留的血液冲洗干净；

3）体积大的组织需切成绿豆大小（2.5-3 mm），每份绿豆大小的组织用无尘纸迅速吸干残余液体，置于事先准备好的细胞冻存管，一份绿豆大小的组织为一管；

4）立即转入液氮速冻2min，转移至-80℃；如没有液氮条件，请立即在干冰放置15 min （建议将装有组织的冻存管迅速放入自封袋，放置在干冰里面），转移至-80℃，干冰运输。

1. CUT&Tag适用于什么物种？

CUT&Tag适用于哺乳动物细胞的蛋白-DNA互作研究，酵母、植物等细胞需要经过(破除细胞壁或者提取细胞核)来进行实验。CUT&Tag在哺乳动物细胞系上的应用比较成熟，动物组织经过处理得到悬浮单个细胞同样可以进行实验。

2. CUT&Tag适用于活细胞，对细胞状态有要求吗？

CUT&Tag在活细胞上确实成功率比较高，在准备细胞时需要保证细胞处于高细胞活性状态，若细胞活性不佳，胞内蛋白质与核酸相互作用的状态会发生改变，对于死亡的细胞，目的蛋白有可能从染色质上脱落，进而影响实验数据。在准备细胞样本时使用台盼蓝进行细胞活性的检测，建议细胞活力大于90%以上。

3. CUT&Tag是否可以用于标签蛋白？

理论上可以。目前已有文献在没有特异性抗体靶蛋白上通过连有Flag、GFP等标签进行CUT&Tag实验。

4. 使用CUT&Tag建议使用什么对照？

试剂和流程的技术性阳性对照推荐使用抗体H3K27me3。如果需要阴性对照我们建议仅使用二抗而不使用一抗，这将显示二抗和pA-Tn5在你的样本中的背景。

5. ChIP-Seq验证的抗体是否可以用于CUT&Tag ？

CUT&Tag和ChIP Seq有不同的工作流程。如果一个抗体对ChIP-Seq有效，那并不一定意味着它适用于CUT&Tag。我们建议使用已经在文献中验证的抗体，或者尝试ChIP级别或者经过ChIP实验验证的抗体。

6. 客户有动物组织，建议消化成原代细胞送样还是将组织冻存送样？

建议寄送冻存组织。CUT&Tag对细胞的活性要求较高，原代细胞通常活性偏低，冻存复苏后的细胞活性很难达到送样要求，建议将新鲜组织清理冻存，及时送样。

7. 细胞量很少时，应该怎么送样呢？

细胞量低至1000个细胞以下时，其送样与常规细胞量项目有区别，原则在于避免样本损失，我们建议：将细胞悬在10 μL PBS中即可（使用低吸附的PCR管），液氮速冻干冰运输。