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PCR（聚合酶链式反应）自1985年问世以来，对生命科学产生了深远影响，广泛应用于医疗诊断、法医检测等领域。PCR通过变性、退火和延伸三个步骤，利用引物和耐热DNA聚合酶实现DNA的高效扩增。常规PCR反应包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP和含镁离子的缓冲体系，现代PCR试剂通常将除引物和模板外的试剂预配置成Mix，简化实验操作。PCR技术的发展历程中，关键人物和事件包括沃森和克里克提出DNA双螺旋结构、Kornberg发现DNA聚合酶、Mullis发明PCR等。随着技术进步，PCR衍生出多种类型，如qPCR（定量PCR），通过荧光信号实时监测DNA扩增过程，实现精确定量分析。qPCR常用的方法有SYBR染料法、TaqMan探针法和分子信标法，各有优缺点和适用场景。

qPCR引物设计遵循PCR基本规律，因定量方式不同而有所区别。SYBR染料法引物设计需注意引物长度、G+C含量、3'端碱基选择、避免二聚体和发夹结构、Tm值匹配、ΔG值控制、5'端修饰、产物长度及跨越内含子等要点。TaqMan探针法除包含上述原则外，还需注意5'端避免G碱基、探针退火温度高于引物、无连续相同碱基、探针位置靠近上游引物及C碱基多于G碱基等。对于RNA样本定量，还需考虑引物特异性、可变剪切、扩增效率、引物生产工艺及跨内含子设计，以确保准确检测。引物设计软件如Primer Premier、Oligo7等，及在线工具如Primer-blast、Primer3 Plus等，可辅助设计。设计流程包括在NCBI检索目的基因、设定参数、获取引物对并验证唯一性，最后进行PCR验证，确保产物特异性。启衡星StarLighter SYBR Green qPCR Mix优化配方，有助于解决非特异性扩增问题，简化引物设计及验证流程，节省时间和成本。

11月30日下午，北京普凯瑞携启衡星qPCR Mix产品亮相中国农业科学院蔬菜花卉研究所，会议现场座无虚席。产品经理介绍了荧光定量PCR技术原理、解析方法及启衡星qPCR Mix产品优势，包括更高荧光信号强度、改善信噪比、扩增特异性强、Ct值提早出现、高灵敏度、低拷贝检测灵敏度高、高GC或高AT片段扩增效果好以及耐受抑制剂能力强等特点。现场学生认真听讲并做笔记，会议结束后与产品经理及技术老师积极交流，对产品表示认可并愿意试用。会议还设置了抽奖环节，获奖者均为女性。普凯瑞还发布了试用有礼活动，得到现场学生积极参与。会议在中国农业科学院的大力支持下圆满结束。

荧光定量PCR实验设计需根据目的选择相对定量或绝对定量方法。相对定量用于检测不同样本中基因的相对表达差异，常用ΔΔCT法或相对标准曲线法，需选择合适的内参基因以排除人为误差；绝对定量用于检测样本中基因或物种的准确含量，需构建标准曲线。预实验至关重要，通过特异性引物设计预实验，验证引物及操作的准确性，确保实验的准确度、重复性和宽动力学范围。实验中需设置阳性和阴性对照，进行系统检测。绝对定量法需构建已知浓度的标准品，通过标准曲线计算样本浓度；相对定量法通过内参基因校正，获得目的基因的表达差异。整个实验过程中，需考虑生物学重复及技术重复，以确保结果的可靠性。

qPCR因操作简单、检测快速、灵敏度高和特异性好，已成为核酸定量实验的金标准，并广泛应用于生命科学、农学、分子诊断和医学等领域。核酸提取及质控是qPCR实验的关键初始环节，正确的样本采集和处理方式，以及有效的核酸提取和严格的质控是确保实验结果准确的重要保障。样本采集时需注意量、部位和时间的一致性，以及采集环境和保存方法。核酸提取方法包括有机溶剂提取法、膜柱法和磁珠吸附提取法，每种方法都有其优缺点和适用场景。核酸质量质控包括定量质控、纯度检测和完整性检测，常用的量化方法有分光光度法、微流控分析法、毛细管凝胶电泳法和荧光染料检测法。不同的质检方法有各自的优缺点，选择合适的方法可以确保核酸样品的质量，从而提高qPCR实验的准确性和可靠性。

二代测序（NGS）即大规模平行测序，可同时对大量DNA分子测序，是继Sanger测序后的革命性进步，具有高通量、高灵敏度和特异性，能定性和定量检测，且检测费用相对较低，在无创产前筛查、肿瘤基因突变等领域应用前景广阔，是精准医学时代的重要支撑技术。NGS操作步骤多、程序复杂，包括样本预处理、核酸提取、建库、测序及后续的生物信息学分析等，任一环节出问题都会影响检测结果的准确性。在我国，肿瘤患者众多，对驱动基因诊断和检测的需求巨大，但检测技术准入门槛低、缺乏公认的指导规范，可能导致检测质量低下、结果准确性差等问题。今年7月，《中华医学杂志》发表了《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》，对NGS技术的多个方面进行了讨论和规范性建议。NGS应用中的样本处理需根据样本类型选择合适的保存和处理方法，核酸提取和质量评估也需采用合适的技术和方法，文库制备和质控是成功进行NGS的关键，需监控每个步骤并确保文库的质量。

RT-PCR中，将RNA高效反转为cDNA是关键且易出错的一步。反转录前需考虑RNA的浓度、纯度和完整性，这些因素影响反转录效率和定量准确性。RNA起始量应根据实验情况调整，遵循相同起始量原则，对于低丰度基因可增加起始量。基因组DNA污染可通过DNaseⅠ处理解决。高GC含量基因反转录可选择耐高温的酶或预先处理以提高效率。RNA二级结构可通过使用Oligo dT和随机引物混合、高温反转录或两步法来提高反转录效率。引物选择需根据模板特性，随机引物适用于复杂或降解模板，Oligo dT特异性高但受结构影响大，混合使用可提高效率，基因特异性引物是qPCR的首选。操作过程中需注意避免RNase污染，使用DEPC处理的器具和无RNase试剂，并在低温下保存反转录试剂。

qPCR数据分析包括相对定量和绝对定量，实验室常用相对定量。绝对定量通过已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，利用Log（起始浓度）与循环数的线性关系，计算样品中模板量，需确定目的基因、标准样本、重复反应孔、标记方法等，以染料法为例，要制备质粒标准品并进行拷贝数计算和梯度稀释，实验中用启衡星SYBR Green qPCR Mix等试剂，进行引物设计、DNA提取、PCR扩增和结果分析，计算得出样品中基因的copy数。相对定量比较样本间基因表达量差异，需参照样本、未知样本、目的基因、管家基因等，常用方法有双标准曲线法和2－△△Ct法，双标准曲线法数据准确但需每轮做标准曲线，2－△△Ct法流程简单但假设扩增效率为100%，实际操作中推荐做标准曲线校正结果，修正公式为E－△△Ct。