“我的基因，RNA-seq显示有转录，Western Blot也证实有蛋白，可为什么用qPCR就是检测不到它的mRNA信号？”
你是否曾经遇到过这样的问题？
当你反复检查qPCR实验步骤，甚至检查到怀疑人生时，请先记住一个核心事实：RNA-seq和WB的结果已经强烈暗示，该基因的转录和翻译事件很可能真实发生了。
问题往往不在于生物学本身，而在于连接两者的技术桥梁——qPCR，以及背后更深的生物学逻辑。
之前的解答多集中于技术排查，这完全正确，我们今天给大家提供一个新的问题解决思路，即引入一个能直击问题本质的“神器”——新生RNA捕获技术，它将为你揭开谜底，并打开一扇新的研究大门。
Part One 常规排查——90%的问题出在这里
当遇到这个问题时，首先请进行以下“体检”：
qPCR引物设计（最大嫌疑）
引物是否恰好位于可变剪接区？
是否因为二级结构或形成二聚体而失效？
最简单有效的验证方法是进行普通PCR+琼脂糖凝胶电泳，观察是否有预期大小的单一明亮条带。
反转录效率
是否使用了不合适的反转录引物（如Oligo dT）？
对于长转录本或结构复杂的mRNA，建议尝试基因特异性引物（GSP） 进行反转录，能极大提升cDNA产量。
表达量与灵敏度
目标基因表达量可能极低，处于qPCR检测的临界值附近，任何微小的效率损失都会导致信号丢失。
如果以上步骤排查无误，那么恭喜你，你可能触碰到了一个更有趣的深层生物学问题。
Part Two 进阶探索——当技术差异揭示生物学奥秘
此时，RNA-seq与qPCR的矛盾不再是烦恼，而是发现新机制的契机。
可能性一：隐秘的转录本异构体
问题根源：RNA-seq检测的是所有转录本的总和，而你的qPCR引物可能只针对其中一种异构体。如果在你实验条件下，主要表达的是另一种引物无法识别的异构体，qPCR自然“哑火”。
传统验证的局限：常规重新设计引物如同盲人摸象，费时费力。
终极解决方案：【新生RNA捕获测序】
这项技术能直接捕获细胞内最新合成、未经剪接加工的新生RNA。通过对其进行测序，你可以像查看“设计图纸”一样，直观地看到所有正在转录的、包含内含子的原始转录本，精准定位哪些异构体是活跃转录的。据此信息重新设计qPCR引物，必能一击即中。
可能性二：昙花一现的瞬时转录与严格的转录后调控
问题根源：这是最可能被忽略的精彩剧情。你的基因可能像一个“警报器”，只在特定刺激下瞬时、高强度地爆发转录，随后mRNA被迅速降解。而蛋白质则相对稳定，得以留存。
剧情还原：在T0时间点，给予刺激 -> mRNA水平在T1时间点瞬间达到峰值 -> 在T2时间点取样时，mRNA高峰已过，但蛋白质已合成并积累。
结果解读：RNA-seq因其高灵敏度和建库中的PCR扩增，可能捕捉到了mRNA衰减期的“余音”。而qPCR在你取样的T2时间点已无法检测。WB检测到的则是T1峰期合成的稳定蛋白质。
传统验证的局限：盲目地在不同时间点取样做qPCR，工作量巨大且如同大海捞针，很难抓住那个精确的峰值时刻。
终极解决方案：【时间序列新生RNA捕获 + RT-PCR&qPCR】
通过设计精细的时间点实验，并利用新生RNA捕获技术富集每个时间点的最新转录本，再进行RT-qPCR。你可以清晰地绘制出该基因转录动力学的精确曲线，直接“看到”那个短暂的mRNA高峰，从而完美解释为何在常规取样点检测不到。这不仅解决了问题，更深入到了基因调控的核心。
当多组学数据出现矛盾时，不要轻易否定任何一方。这往往是你的研究触及更深层生物学机制的信号。
新生RNA捕获技术，正是将你从“技术 troubleshooting”的泥潭中解放出来，直接通往“机制深度探索”的快车道。它不仅是验证疑难杂症的终极工具，更是研究转录起始、转录动力学、可变启动子等前沿领域的强大平台。
