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荧光定量PCR实验设计需根据目的选择相对定量或绝对定量方法。相对定量用于检测不同样本中基因的相对表达差异，常用ΔΔCT法或相对标准曲线法，需选择合适的内参基因以排除人为误差；绝对定量用于检测样本中基因或物种的准确含量，需构建标准曲线。预实验至关重要，通过特异性引物设计预实验，验证引物及操作的准确性，确保实验的准确度、重复性和宽动力学范围。实验中需设置阳性和阴性对照，进行系统检测。绝对定量法需构建已知浓度的标准品，通过标准曲线计算样本浓度；相对定量法通过内参基因校正，获得目的基因的表达差异。整个实验过程中，需考虑生物学重复及技术重复，以确保结果的可靠性。

qPCR因操作简单、检测快速、灵敏度高和特异性好，已成为核酸定量实验的金标准，并广泛应用于生命科学、农学、分子诊断和医学等领域。核酸提取及质控是qPCR实验的关键初始环节，正确的样本采集和处理方式，以及有效的核酸提取和严格的质控是确保实验结果准确的重要保障。样本采集时需注意量、部位和时间的一致性，以及采集环境和保存方法。核酸提取方法包括有机溶剂提取法、膜柱法和磁珠吸附提取法，每种方法都有其优缺点和适用场景。核酸质量质控包括定量质控、纯度检测和完整性检测，常用的量化方法有分光光度法、微流控分析法、毛细管凝胶电泳法和荧光染料检测法。不同的质检方法有各自的优缺点，选择合适的方法可以确保核酸样品的质量，从而提高qPCR实验的准确性和可靠性。

二代测序（NGS）即大规模平行测序，可同时对大量DNA分子测序，是继Sanger测序后的革命性进步，具有高通量、高灵敏度和特异性，能定性和定量检测，且检测费用相对较低，在无创产前筛查、肿瘤基因突变等领域应用前景广阔，是精准医学时代的重要支撑技术。NGS操作步骤多、程序复杂，包括样本预处理、核酸提取、建库、测序及后续的生物信息学分析等，任一环节出问题都会影响检测结果的准确性。在我国，肿瘤患者众多，对驱动基因诊断和检测的需求巨大，但检测技术准入门槛低、缺乏公认的指导规范，可能导致检测质量低下、结果准确性差等问题。今年7月，《中华医学杂志》发表了《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》，对NGS技术的多个方面进行了讨论和规范性建议。NGS应用中的样本处理需根据样本类型选择合适的保存和处理方法，核酸提取和质量评估也需采用合适的技术和方法，文库制备和质控是成功进行NGS的关键，需监控每个步骤并确保文库的质量。

RT-PCR中，将RNA高效反转为cDNA是关键且易出错的一步。反转录前需考虑RNA的浓度、纯度和完整性，这些因素影响反转录效率和定量准确性。RNA起始量应根据实验情况调整，遵循相同起始量原则，对于低丰度基因可增加起始量。基因组DNA污染可通过DNaseⅠ处理解决。高GC含量基因反转录可选择耐高温的酶或预先处理以提高效率。RNA二级结构可通过使用Oligo dT和随机引物混合、高温反转录或两步法来提高反转录效率。引物选择需根据模板特性，随机引物适用于复杂或降解模板，Oligo dT特异性高但受结构影响大，混合使用可提高效率，基因特异性引物是qPCR的首选。操作过程中需注意避免RNase污染，使用DEPC处理的器具和无RNase试剂，并在低温下保存反转录试剂。

qPCR数据分析包括相对定量和绝对定量，实验室常用相对定量。绝对定量通过已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，利用Log（起始浓度）与循环数的线性关系，计算样品中模板量，需确定目的基因、标准样本、重复反应孔、标记方法等，以染料法为例，要制备质粒标准品并进行拷贝数计算和梯度稀释，实验中用启衡星SYBR Green qPCR Mix等试剂，进行引物设计、DNA提取、PCR扩增和结果分析，计算得出样品中基因的copy数。相对定量比较样本间基因表达量差异，需参照样本、未知样本、目的基因、管家基因等，常用方法有双标准曲线法和2－△△Ct法，双标准曲线法数据准确但需每轮做标准曲线，2－△△Ct法流程简单但假设扩增效率为100%，实际操作中推荐做标准曲线校正结果，修正公式为E－△△Ct。

启衡星生物科技有限公司是一家专注于分子生物学产业链上游核心原料的高新技术企业，主要从事分子、蛋白酶相关的试剂研发、生产和销售。 其研发的产品涵盖qPCR、NGS、PCR、分子、体外转录、抗体、蛋白纯化、蛋白分析、重组蛋白、高通量测序、报告基因检测、试剂盒的开发等多个品类，广泛应用于生命科学研究、诊断检测以及生命科学等领域。

启衡星生物科技有限公司是一家专注于分子生物学产业链上游核心原料的高新技术企业，主要从事分子、蛋白酶相关的试剂研发、生产和销售。 其研发的产品涵盖qPCR、NGS、PCR、分子、体外转录、抗体、蛋白纯化、蛋白分析、重组蛋白、高通量测序、报告基因检测、试剂盒的开发等多个品类，广泛应用于生命科学研究、诊断检测以及生命科学等领域。

多重PCR（MPCR）是在常规PCR基础上发展起来的，可在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多个核酸片段，具有特异性、敏感性，且更快捷经济，在多领域广泛应用。实际操作中，需在多个靶点扩增条件间达到平衡，实现引物间的完美兼容性。启衡星StarLighter Multiplex PCR Mix专为多重PCR扩增设计，采用优化的StarLighter Taq Pro DNA聚合酶和缓冲液体系，使不同大小和GC含量的扩增子均一有效扩增，通过特异性抗体实现热启动，避免非特异性结合和扩增，且退火、延伸一步进行，减少反应时间，兼容多种样本。产品优势包括高效扩增、抗抑制因子能力强，使用便捷。实验案例显示，以人血卡纸为模板，用40对Y染色体引物和28对常染色体引物进行多重扩增，毛细管电泳结果均显示有效扩增。