荧光定量PCR实验方法设计

荧光定量PCR实验方法设计

荧光定量实验设计时，定量方法怎么选？相对定量还是绝对定量？相对标准曲线法还是ΔΔCT法？

荧光定量PCR实验方法要根据试验目的进行设计。一般来说荧光定量PCR要达到的目的有两种：

1 检测样本中某个基因或物种的准确含量，这种方法称为绝对定量法。如一定体积血液中某病毒的含量，或一定水体中某种菌的含量。

2 检测不同样本中某个基因的相对表达情况，这种方法称为相对定量法。如经过不同处理，植物组织中某个基因的表达上调或下调情况

预实验很重要

在我们展开阐述绝对定量和相对定量的具体实验设计之前，我们先了解荧光定量实验要达到准确定量样本的前提是什么？

·      准确度高——荧光信号-CT值与目的产物呈标准线性关系；

·      重复性好——3个及以上重复操作且误差范围小；

·      动力学范围宽——在较宽的浓度范围内能检测准确。

以上要求，我们都可以通过预实验来进行判断：根据我们上一篇引物设计的介绍，设计出特异性定量引物，使用特异性引物设计预实验：

引物及操作验证

对一个样本的核酸进行连续梯度稀释（推荐5个点的10倍稀释，如果cDNA浓度太低可降低稀释倍数），每个点设置3个及以上重复，绘制标准曲线。通过该标准曲线观察，一般认为R²≥0.99，实验操作符合要求，扩增效率E=90%-110%，引物扩增效率符合要求。

系统检测

设置阳性和阴性对照。

阳性对照即100%能扩增出荧光信号的对照组如标准品、内参等。如果阳性对照无扩增，则需要检查仪器、试剂等系统问题。

阴性对照即正常情况下不能扩增出荧光信号的对照组。

无模板对照（NTC）：以水为模板，观察扩增情况，如果NTC出现扩增，则可以根据溶解曲线TM值初步判断是污染造成的产物还是引物二聚体。

无反转录对照（NRC）：用于cDNA定量实验，监控基因组污染情况（如果能跨内含子设计定量引物，也可避免该问题）。在反转录的时候配置一个不加反转录酶的体系，其余成分正常添加，经历相同的反转录过程，以此为模板，观察扩增情况。如果以基因组DNA为模板，只需进行NTC检测。

引物、操作、系统等验证好之后，我们就可以进行样本的定量实验了。在定量实验中，同样需要设置重复和对照。

绝对定量法

绝对定量首先需要构建已知浓度的标准品，利用标准品构建绘制浓度和CT值对应关系的标准曲线，从而计算样本的浓度。

标准品的获得

使用定量引物扩增出目的产物，克隆并提取质粒，以质粒作为标准品；使用特定引物，扩增出含目的片段的产物，该产物比目的片段长，以该产物作为标准品；以体外转录的RNA作为标准品。

标准品浓度测定

标准品的绝对浓度必须通过其他独立的方法获取。标准品浓度可使用分光光度计在 A260 处测量得到（要求样本纯度高），也可使用荧光染料法（Qubit、酶标仪等）进行浓度测定。根据质量浓度计算拷贝数浓度。

示例：DNA标准品浓度为10ng/µL,标准品2500bp，公式整理如下：

(6.02 x 10²³) x (10ng/µL x 10^-9)/(2500bp x 660)=3.65 x 10⁹copies/µL

标准曲线绘制

根据标准品的浓度，稀释到合适的浓度范围后，再进行连续梯度稀释（推荐5个点的10倍稀释）。

样本浓度计算

与标准品同时进行荧光定量反应，将标准品拷贝数浓度在定量仪器上设置好后，会根据样本的CT值自动给出样本的拷贝数浓度，或手动代入标准曲线公式计算样本拷贝数浓度。

相对定量法

相对定量与绝对定量不同，检测的是表达量差异，所以为了得到真正存在的差异，先要排除人为引入的误差。如样本取样质量或体积误差、样本提取得率误差、反转录误差等问题。在此引入了内参基因的概念。内参基因的作用就是去除不同样本在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，从而获得目的基因特异性表达的真正差异。

选择内参基因

内参基因的选择标准如下：

·              高度或中度表达，排除太高或者太低；

·              表达水平不受任何外源性因素等影响；

·              不存在假基因。

目前常用的内参基因有GAPDH、β-actin、18S rRNA等。同一内参基因在不同的组织中表达不是恒定的，如心、脑、肺、肝、骨骼肌、肾等。

相对定量法

相对定量与绝对定量不同，检测的是表达量差异，所以为了得到真正存在的差异，先要排除人为引入的误差。如样本取样质量或体积误差、样本提取得率误差、反转录误差等问题。在此引入了内参基因的概念。内参基因的作用就是去除不同样本在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，从而获得目的基因特异性表达的真正差异。

选择内参基因

内参基因的选择标准如下：

·              高度或中度表达，排除太高或者太低；

·              表达水平不受任何外源性因素等影响；

·              不存在假基因。

目前常用的内参基因有GAPDH、β-actin、18S rRNA等。同一内参基因在不同的组织中表达不是恒定的，如心、脑、肺、肝、骨骼肌、肾等。

不同的内参基因在不同组织中△CT变化

同一内参基因在同一组织的不同状态时，表达也有可能不同。如GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，在细胞的增殖过程中，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。如在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致，此时建议慎重选择内参。

基于内参基因的非恒定性，所以在实验设计时，会增加内参基因选择的qPCR实验（取样质量或体积控制、核酸浓度控制等），通过实验检测内参基因在实验样本中的表达稳定性，选择最稳定的内参基因；或者选择两个或三个内参基因，计算平均值作为内参数据。

选择好内参基因之后，我们就可以进行相对定量实验了。相对定量法又分为标准曲线法和ΔΔCT法。

相对标准曲线法

相对标准曲线法实验设计：

·      用目的基因和内参基因的标准品分别获得标准曲线（此处的标准曲线不需要标准品的准确浓度，所以也可以使用cDNA作为标准品进行连续梯度稀释，按照倍数关系虚拟数字作为标准品浓度）；

·      处理样本与对照样本同时扩增目的基因和内参基因，获得CT值，用内参基因对目的基因均一化；

·      均一化之后得出处理样品与对照样本中目的基因的表达差异。

相对标准曲线法的特点：

·      考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；

·      对引物的扩增效率要求没有ΔΔCT法高；

·      其不足之处是每次实验都必需对目的基因和内参基因做标准曲线；

·      该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。

ΔΔCT法  

ΔΔCT法实验设计：

·      使用ΔΔCT法的前提是目的基因和内参基因的扩增效率都接近100%，且偏差在5%以内；

·      将样本的目的基因CT值减去内参基因的CT值，得到样本的ΔCT；

·      再用处理样本的ΔCT减去对照样本的ΔCT，得到ΔΔCT；

·      使用公式2^-ΔΔCT计算处理样本与对照样本的表达量差异。

这种方法通量大（没有标准品占用孔位），对引物扩增效率要求高，准确性略低于相对标准曲线法。

在整个实验过程中，均需要考虑生物学重复及技术重复问题，针对具体定量结果的实验数据分析，我们会在后续相应主题中进行讲解。