超全PCR实验排雷手册（2025最新版）

引物设计不适，与目的序列具有同源性

试剂污染：水、移液枪等被核酸污染

样品间出现交叉污染

环境消毒：实验台、移液器高压灭菌，使用无菌水

耗材管理：离心管/枪头一次性使用，试剂（除酶外）高压灭菌

操作规范：分区操作（试剂配制区、样本处理区、扩增区）

技术优化：采用巢式PCR或高特异性试剂盒

酶用量：减少Taq酶用量或改用热启动酶

模板质量：纯化DNA/RNA模板，去除蛋白质/多糖杂质

体系平衡：降低dNTP浓度（<0.2mM），优化Mg²⁺浓度（1.5-2.5mM）

循环数：减少循环次数（通常25-35次）

引物设计：避免引物间互补，3'端避免连续3个G/C

反应条件：降低Mg²⁺浓度，提高退火温度

模板量：增加模板投入量（50-100ng）

保守区定位：优先选择模板cDNA的保守区域

长度与GC含量：15-30bp，GC%<60%，3’端不超过连续三个 G 或 C

二级结构：避免引物自身形成发夹结构或二聚体

BLAST验证：确保引物与基因组其他区域无同源性

一查模板纯度（抑制剂/降解）

二验引物设计（BLAST/二聚体）

三调反应体系（Mg²⁺/酶量/温度）