一、概述
耐药基因筛查旨在通过检测生物体（包括病原微生物、肿瘤细胞等）基因组中是否携带已知的介导耐药性的遗传标记，来预测或确认该生物体对特定药物（如抗生素、抗病毒药、抗肿瘤药）的治疗反应。
其核心逻辑是：耐药性通常由特定的基因所介导。检测到这些基因，就意味着生物体可能对相应药物产生耐药性。
荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）作为一种高效、灵敏、特异的分子诊断技术，已成为现代药物基因组学与耐药基因筛查领域的核心工具。其在临床个体化用药指导、病原体耐药性快速检测及肿瘤靶向治疗监测中发挥着不可替代的作用。
二、耐药基因筛查中的耐药基因类型
如细胞色素P450家族基因（CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4, CYP3A5等）的多态性。这些基因的变异直接影响药物在体内的代谢速度，导致疗效不佳或毒副作用增加。例如：CYP2C19：与氯吡格雷等药物的代谢相关，不同基因型可分为超快代谢型、快代谢型、中间代谢型和慢代谢型。
如ABCB1（P-糖蛋白）基因的多态性。这些基因变异影响药物在体内的吸收、分布和排泄。
如VKORC1（华法林作用靶点）、SLCO1B1（他汀类药物转运体）等基因的变异。这些变异会导致药物对靶点的作用强度改变。
三、耐药基因筛查中主要应用的qPCR技术
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技术类型 |
核心原理 |
主要应用场景 |
优点 |
局限性 |
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TaqMan探针法 |
采用序列特异性探针，5'端报告荧光基团，3'端淬灭基团。PCR扩增时Taq酶具5'→3'外切酶活性水解探针，释放荧光 |
特定点突变（如EGFR T790M）、SNP分型（如CYP2C19*2, *3）、药物代谢酶基因多态性检测、绝对定量 |
特异性高、可多重检测、定量准确、重复性好 |
探针成本较高、设计难度相对大 |
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分子信标 (Molecular Beacons) |
发夹结构的茎环设计，环部与靶序列互补，茎部使荧光基团与淬灭基团靠近。仅与完全匹配靶标结合时发夹打开产生荧光 |
点突变检测（如结核分枝杆菌gyrA基因耐药突变）、区分单核苷酸多态性（SNP） |
特异性极强、能有效区分单碱基突变、信噪比高 |
设计复杂、成本高、优化难度较大 |
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高分辨率熔解曲线 (HRM) |
使用饱和荧光染料（如SYTO9），PCR后通过缓慢升温并实时监测荧光变化。突变会导致扩增产物熔解温度（Tm）变化 |
SNP筛查、突变扫描、甲基化检测、中等通量的未知突变筛查 |
无需序列特异性探针、成本较低、闭管操作减少污染、可发现未知突变 |
对仪器分辨率要求高、引物设计要优化、可能需测序验证 |
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SYBR Green染料法 |
SYBR Green染料非特异性地嵌入双链DNA小沟中，发射荧光。荧光强度与双链DNA产量成正比 |
基因表达相对定量（如药物代谢酶mRNA水平）、微生物负载量检测、拷贝数变异（CNV）初步筛查 |
成本低、使用方便、无需特异探针、应用灵活 |
特异性相对较低、对引物特异性和反应条件要求高 |
四、通过qPCR技术开发耐药基因检测试剂的关键因素
五、启衡星生物在耐药基因试剂开发中的优势
六、目前应用较多的靶标基因汇总
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类型 |
基因 |
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药物转运相关 |
SLCO1B1*5、ABCB1、ABCG2、SLCO1B1、ABCC4 |
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药物代谢酶 |
CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、DPYD、CYP2C9*3、DPYD*13、DPYD*2A、CYP3A5*3、GSTP1、CYP2B6、CYP2D6*10、NUDT15、TPMT*3C、ALDH2、CYP1B1、NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7、UGT1A1*28、UGT1A1*6、UGT2B7、CYP2C8、NT5C2、SOD2 |
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药物靶点相关 |
ApoE、FKBP5、ADRB2、OPRM1、ACE、ERCC1、IFNL3、TNF、ADD1、ADRB1、CACNA1C、CEP72、DRD2、GP1BA、VKORC1 |
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其他 |
HLA-B*57:01:01、HLA-B*58:01、、HLA-B*15:02、HLA-A*31:01、HLA-B*38:02:01MTHFR、COQ2、TP53、MTRR、CDKAL1、PAI-1、KIF6、TCF7L2、IRS1、F11、GNB3、ITPA、PROC、C11orf65、C8orf34、CREB1、CYP19A1、FGG、GSDMB、LTC4S、PRKCA、SEMA3C、THBD、VDR、XPC |
