产品介绍
本试剂盒适用于llumina平台的新生RNA转录组文库构建试剂盒，操作简单，建库时间短，效果稳定，适用于活体动物、植物、活细胞等多种类样本的新生RNA文库构建。本试剂盒使用5-乙炔基尿嘧（EU）标记活细胞中的新生RNA，然后通过点击化学反应，使新生的RNA标记上生物素，再通过链霉亲和素磁珠特异性捕获新生的RNA，最后对新生的RNA进行文库构建。结合实验时间设计，能够对新生成的RNA进行定量分析，同时能够研究RNA转录水平和降解问题。
产品特点
试剂盒1：2~8℃保存，有效期12个月；
试剂盒2：-25~-15℃保存，有效期12个月；
试剂盒3：-25~-15℃保存，有效期12个月。
1.1 细胞样本EU孵育
细胞密度在70-90%或细胞密度达到实验设计的需求，进行EU孵育。使用完全培养基进行稀释EU，常见细胞EU的使用终浓度为1 mM，孵育2小时。或根据文献报道，也可调整EU终浓度以及孵育时间。初次实验，可按照推荐EU剂量和时间进行预实验；如T25瓶的细胞将其培养基去除后，将配置好的含有1 mM EU培养基加入到培养瓶中进行孵育2小时*。按照步骤2进行后续实验。下表为推荐测试的EU剂量和时间：
1.2 动物组织EU孵育
根据动物体体重进行注射或灌胃，可以按照200-400 mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，进行注射或灌胃。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，如初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后*或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织。按照1中步骤2进行后续实验。
*实验验证过小鼠、大鼠、黄鼠、兔子等常见动物模型。
1.3 植物样本EU孵育
根据植物体的培养环境进行添加EU进行孵育，用量可以参考相关文献进行，对于液培可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时*，可根据自己方法提取RNA，提取完RNA后，进行第2步点击反应后续实验。
*实验验证过水培和土培的人参、多种花卉和粮食作物等。
2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 ml TRIZOL将细胞裂解，置于无酶EP管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，取到相应组织后，用无酶PBS清洗组织2-3次，将其置于1 mL TRIZOL中使用研磨仪器研磨直至看不到组织块，置于无酶EP管中，室温静置5 min；
2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；
2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；
2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；
2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；
2.6 重复步骤6；
2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。
2.8 rRNA去除，推荐启衡星核糖体RNA去除试剂盒进行rRNA的去除（这一步为推荐选项，rRNA去除可以提高目标RNA的检测灵敏度以及减少测序量）。
3.1 点击反应液配制
3.2 每个样本中加入150 μL点击反应液，涡旋混匀；
3.3 冰上静置30 min；
3.4 向点击反应液中加入1 ml TRIZOL，涡旋混匀；
3.5 重复RNA提取过程（TRIZOL法提取）。
4.1 涡旋振荡使链霉亲和素磁珠充分悬浮，不要离心，以防磁珠沉降；
4.2 每个样品取20 μL重悬好的磁珠到一个新的EP管中。对于多个样品所需SMB磁珠的清洗，可一起进行，如将6 个(120 μL)或12个样品(240 μL)的磁珠分装在一个管中进行清洗。每20 μL链霉亲和素磁珠加入20 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.3 取下装有磁珠的EP管后，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.4 同步骤4.2操作，每20 μL链霉亲和素磁珠使用40 μL溶液A清洗2次，接着使用40 μL溶液B清洗2次；
4.5弃上清后，向磁珠（每个样）中加入50 μL的2×Wash Buffer重悬；
5.1向第3步中得到的RNA，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；
5.2涡旋混匀后，室温孵育20 min，将EP管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；
5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。
6.1 将样品重新放回至磁力架中，室温静置 5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用 10 μL 移液器吸干净残留液体；
6.2 将样品从磁力架上取出，用 18 μL Frag/Prime Buffer 重悬磁珠，用移液器吹打 6 次以彻底混匀；将样品置于 PCR 仪中（预设为 94°C），94°C，7 min。
6.3进入第一链合成。
7.1 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按下表所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
7.2 使用移液器轻轻吹打或涡旋混匀，瞬离将反应液离心至管底。
7.3 将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，按照下表所示设置反应程序，进行第一链 cDNA 的合成。反应结束后立即进行第二链 cDNA 的合成。
8.1 将第二链合成试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀；按照下表所示，配制第二链 cDNA 合成/末端修复/加 A 反应液。
8.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
8.3 将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，按照下表所示设置反应程序，进行第二链 cDNA 的合成。
该步骤可在末端修复和 dA 尾添加的产物末端，连接特定的 Illumina ®接头。 将下表中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
9.1 于上述步骤结束后的 PCR 管中继续配制下表所示反应体系。
9.2 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
9.3 将 PCR 管置于 PCR 仪中，设置下表所示反应程序，进行接头连接反应：
10.1 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
10.2 在上述 100 μL 的连接体系中加入第一轮分选磁珠 20 μL (0.20 ×)，涡旋或移液 =器吹打 10 次混匀。室温孵育10 min。
10.3 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约 5 min），小心转移上清到干净的离心管中。
10.4 向上清中加入第二轮分选磁珠 0.10×（120 μL × 0.1=12 μL）。
10.5 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。
10.6 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约 3 min），小心移除上清。
10.7 保持 PCR 管始终处于磁力架中，加入200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec，小心移除上清。
10.8 重复步骤 7。
10.9 保持 PCR 管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约 3 min）。
10.10 将 PCR 管从磁力架中取出，加入 21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置 5 min。
10.11 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约 3 min），小心转移 20 μL 上清至干净管中。
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行 PCR 扩增富集。
11.1 将下表中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
11.2 于无菌 PCR 管中配制下表所示反应体系。
11.3 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
11.4 将 PCR管置于PCR仪中，设置下表示反应程序，进行 PCR 扩增。
12.1 准备工作：将 StarPure DNA Size Selection Kit-V2由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min，同时配制 80%乙醇。
12.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
12.3 吸取 45 μL Beads (0.9×，Beads : DNA=0.9:1)至 Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育 5 min。
12.4 将EP管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。
12.5 保持EP管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
12.6 重复步骤 5，总计漂洗两次。
12.7 保持EP管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过 5 min）。
12.8 将EP管从磁力架中取出，加入 21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。将EP管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 3 min）；
12.9 小心移取 20 μL 上清至新EP管中，进行文库定量、 质检。
