基因表达本质上呈现动态特征，常规差异基因表达分析（DRE)因其技术限制，难以捕捉复杂转录调控中的瞬时变化及不稳定非编码RNA（如增强子RNA）。在此背景下，RNA测序技术通过定位转录起始位点和定量新生RNA，为研究RNA动力学提供了重要手段。
然而，相较于传统的DGE分析，新生RNA的研究面临更多挑战，主要源于其半衰期较短且丰度较低的特性。近年来多种专门针对新生RNA的分析方法应运而生，这些技术揭示了启动子区域的转录活跃程度，尤其是转录激活状态下的PolⅡ在启动子近端的停留时间，是基因表达调控的关键环节。此外，新生RNA不仅能直接影响转录过程，其序列和结构特征还对转录延伸、暂停及停滞等动态行为产生调控作用，并参与染色质修饰酶及增强子RNA的结合过程。目前，旨在区分新合成RNA与其他RNA的新生RNA-seq技术主要分为三类：基于转录run-on的方法、依赖PolⅡ免疫沉淀（IP）的技术，以及代谢标记法。
1. Run-on法
通过在转录过程中掺入核苷酸类似物，从总RNA中富集新生RNA，并用于测量瞬时转录活性（图a）。其中，Global run-on sequencing（GRO-seq）和Precision nuclear run-on sequencing（PRO-seq）分别利用5-溴尿苷5′-三磷酸（BrU）或生物素标记的核苷酸掺入新生RNA，从而定位转录组范围内活跃的RNA聚合酶位置和活性。在实验中，细胞核被分离后，内源核苷酸被洗去，随后添加外源标记核苷酸恢复转录。通过免疫沉淀或亲和层析富集新生转录本，可实现转录活性的高分辨率检测。
GRO-seq由于标记核苷酸掺入量的限制，分辨率仅为10-50 bp，影响转录起始位点（TSS）的精确定位。相比之下，PRO-seq通过在生物素核苷酸掺入后终止转录，实现了单碱基分辨率的定位。尽管Run-on方法概念简单（仅需富集掺入修饰核苷酸的RNA分子），但背景非新生RNA的存在增加了测序所需的读取深度。
这些技术的应用揭示了启动子区域发散或双向转录的广泛存在，并明确了增强子RNA在基因表达调控中的作用。此外，通过结合5′-帽RNA的特异性富集（如GRO-cap、PRO-cap或START-seq），进一步提高了转录起始检测的灵敏度和特异性，同时减少了转录后加帽RNA带来的背景信号干扰。这些改进方法还能够捕获在转录过程中可能被加工去除的RNA，为研究转录动态提供了更全面的视角。
2. PolⅡ免疫沉淀法
如Native Elongating Transcription Sequencing（NET-seq）及其哺乳动物染色质改良版mNET-seq，通过抗体特异性捕获PolⅡ相关RNA来研究转录动态。这些方法利用抗FLAG标签（针对FLAG标记的PolⅡ）或针对PolⅡC末端结构域的抗体，从染色质复合物中富集新生RNA，用于绘制转录起始位点。
尽管这些技术能直接关联RNA聚合酶活性与新生RNA，但存在以下局限性：
2.1 背景RNA干扰：
非新生RNA与PolⅡ的非特异性结合及背景mRNA会增加测序需求并模糊分析结果。
2.2 特异性问题：
NET-seq可能富集与PolⅡ强结合的非新生RNA（如tRNA和小核仁RNA），导致数据污染。
2.3 实验复杂性：
mNET-seq虽能通过多种CTD抗体揭示CTD修饰调控机制并定位新生RNA至TSS，但需要更多细胞、更高测序成本，并依赖复杂实验流程。
3. 代谢标记法
通过核苷酸类似物4-硫尿苷（4 sU）标记新生RNA，从而实现转录动态的检测（图c）。然而，较长标记时间的方法会标记大多数转录本，限制了灵敏度。瞬时转录组测序（TT-seq）和硫醇（SH）-连接的烷基化RNA代谢测序（SLAM-seq）通过靶向RNA的3′末端（即靠近RNA聚合酶的新转录区域）解决了这一问题，减少了5′端RNA的背景信号。
3.1 TT-seq：
·标记时间限制为5分钟，仅标记新转录本的3′末端。
·在生物素亲和纯化前增加RNA片段化步骤，富集标记的RNA，提高检测灵敏度。
3.2 SLAM-seq：
·整合3'mRNA-seq文库制备（也可用于miRNA文库），直接测序标记的新生RNA，而非整个转录本。
·RNA提取后加入碘乙酰胺，烷基化4 sU残基，诱导逆转录依赖的T>C核苷酸转换（表现为测序中的“突变”），从而精确定位4 sU整合位点。
·但低整合率导致只有少数4 sU位点被转换为胞嘧啶，限制了检测敏感性。
3.3 TUC-seq和TimeLapse-seq：
·同样利用T>C突变分析，但不富集3'末端。
·用于研究细胞干扰后的转录响应和RNA半衰期测量。
为克服上述难题，我们开发了一种基于点击化学反应的创新性新生转录本捕获和建库试剂盒，试剂盒使用5-乙炔基尿嘧（EU）标记活细胞中的新生RNA，然后通过点击化学反应，使新生的RNA标记上生物素，再通过链霉亲和素磁珠特异性捕获新生的RNA，最后对新生的RNA进行文库构建。结合实验时间设计，能够对新生成的RNA进行定量分析，同时能够研究RNA转录水平和降解问题。
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