上一期介绍了PCR的发展历史，以及qPCR的基本技术原理。那么这一期，我们也开始如约讲解qPCR实验的引物设计啦！

　　作为PCR技术的一个分支，qPCR的引物设计同样也遵循PCR引物设计时的基本规律。同时，由于qPCR的定量方式主要分为染料法及探针法，因此在引物设计时也有所区别。SYBR染料法在引物设计时遵循的规律与常规PCR差别不大，主要需注意以下几点：

1 . 引物长度一般在17～25碱基之间，G＋C含量在40％～60％之间；

2 . 引物3'端最后一个碱基对Taq酶DNA合成效率有较大的影响，不同末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配率明显高于其他3个碱基，T次之，因此应当避免在引物3'端使用碱基A或T。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物；

3 . 引物碱基要随机分布，自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补；

4 . 引物所对应模板位置序列的Tm值在 72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在Oligo软件中使用的是最邻近法 （the nearest neighbor method）。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度根据较低的 Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从「最近邻位」的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式；

5 . ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反应了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3' 端的ΔG值过高，容易在错配为点形成双链结构并引发DNA聚合反应；

6 . 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体，并降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。产物不能形成二级结构；

7  . 引物 5′端可以修饰，引物 3′端不可修饰；

8  . 定量产物在100-300左右；

9 . 最好跨越一个内含子设计引物。

　　而TaqMan探针法在设计引物时，除了包含SYBR染料法设计时的所有原则外，因为存在探针的缘由，需额外注意5'端不要有G碱基，因为G碱基会淬灭发光基团发出的荧光。另外需要确保TaqMan探针退火温度比引物高10℃，没有连续相同的碱基，探针位置尽可能靠近上游引物，C碱基远远多于G碱基等要素。

　　考虑到目前设计引物的工作主要依靠PC端的专业软件，因此在这里就不对设计时的注意事项进行更多讲解了。顺便给各位推荐几个常用的引物设计软件/网站：

软件：Primer Premier、Oligo7、Beacon Designer

网址：Primer-blast（NCBI）、Primer3 Plus、Primerbank、BiSearch、Pubmed

如果是对RNA样本进行定量，那么设计引物时还需要考虑以下几点：

1、引物特异性

很多人以为引物特异性就是指的扩增产物单一，其实转录组相似序列的干扰也常常是造成检测假阳性的主要原因，尤其是在目标转录本表达水平较低而相似序列表达量高的情形下。对于扩增产物单一性的检测，这就需要查看熔解曲线是否单一，还要看PCR产物电泳图是否单一。如果需要保证高度单一，还可以采用Labchip进行产物分析（可以区分4bp大小的片段）。

2、可变剪切

除此之外，还要特别注意可变剪切。RNA的可变剪切可以导致产生不同的转录本，并导致翻译编码形成多种蛋白，可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。据估计人类基因组出现可变剪切的几率高达60%。当需要检测某个特定剪接体的转录水平时，引物设计需使得扩增子限定在区别于其他剪接体的区段。否则检测到的转录水平是所有剪接体的总和而不是特定剪接体。

3、扩增效率

如果要用ΔΔCt方法进行最后的计算，就需要目的基因和内参基因有相近的扩增效率。较好的引物扩增效率应该在90%-110%，且线性回归系数R²大于0.98。

4、引物生产工艺

引物在生产的过程中一般都会有大约0.01%的错误可能（根据不同生产商，会略有差异）。除此之外，还有副产物（脱盐纯化）以及大量盐分（尤其是page纯化），虽然这不一定影响PCR实验，但是可能会导致实验不稳定。一般在临床试剂中使用的引物和探针都会尽量避免这个问题，而绝大多数科研引物都常常忽略这个问题。

5、引物是否跨内含子

在核酸抽提的过程中，抽提的RNA往往还有少量的DNA（根据不同的抽提试剂盒以及操作本身，比例不同），因此也会对实验结果产生影响。一般跨内含子的引物可以有效区分RNA和DNA样本。可以只检测RNA里的基因表达。

6、引物设计在靠近5'端还是3'端

一般来说，受反转录效率和mRNA降解偏好性差异的影响，靠近3'端的引物能够更好的反映基因的表达情况。

下面我们以NCBI在线primer设计为例给大家分享引物设计的流程：

　1.在NCBI上检索我们想要的目的基因，如下图在右边的菜单栏中点击Pick Primers：

　2. 之后会进入到这个画面，按照我们的需求进行设定参数，如下图：

　3.我们点击Get primers之后，我们就有可能得到好几对引物，如下图：

　4．我们可以从这些引物队中选取我们想要的、最优的引物队就OK啦，是不是So easy？

　5. 最后引物的唯一性验证，我们可以通过Primer-BLAST输入我们的引物序列进行验证：

　6. 验证完之后就可以送公司进行合成啦，当然我们还需要做最后一步工作，就是引物的PCR验证，特别是产物特异性的验证，往往我们设计好的引物，在软件中的表现是完美的，但是在实际PCR的时候就会出现非特异性扩增的问题，这里面有可能是引物本身的原因，也有可能是试剂的原因，配的体系，盐离子浓度等等。而好的试剂是解决非特异性扩增的有利助手，启衡星Starligter SYBR qPCR Mix经过N轮的配方优化，帮您很好的解决了非特异性扩增的问题，为您简化引物设计及验证的流程，节省您的时间及成本！

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