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qPCR 数据分析

发布日期:2018-12-17 返回列表

  师兄、师姐毕业压力大,忙于做实验、写论文,没空带你,而老板又不停催着要结果,实验不顺手,数据分析有一头雾水,怎么办,是不是很抓狂,是不是很心塞,是不是很煎熬?

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  没事,小编为大家排忧解难来了,前几期我们给大家分享了关于qPCR的进化史,引物的设计,实验的设计,反转录的解决方案,本期给大家分享qPCR实验主题的最后一个内容—数据分析,让您的数据结果更加准确,让老板对您刮目相看,是不是很期待呢?

  qPCR的数据分析根据应用的不同可以分成相对定量和绝对定量两种。例如,处理组细胞与对照组细胞相比,A基因的mRNA改变了多少倍,这就是相对定量;那如果说在一定数目的细胞中,A基因的mRNA有多少个拷贝,这就是我们说的绝对定量。通常在实验室中用的最多的就是相对定量的方法了。首先我们先了解一下绝对定量的原理及数据分析流程。

绝对定量的原理和方法

Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系,即

Log2X0 = Log 2M - Ct Log2(1+En)

根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量。

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对于绝对定量我们需要确定几个要素:

• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。

• 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。

• 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。

• 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。

• 实验结果显示 ——扩增曲线;标准曲线;融解曲线(探针法不需要)。

我们以染料法为例,给大家展示在绝对定量中的分析流程:

质粒标准品的制备:

首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段,一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右,然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体,再转到大肠中进行克隆复制,经过质粒的提取及OD值定量或qubit定量(qubit定量从原理上来说要比OD值测定更准确,因此推荐qubit进行质粒浓度测定,推荐使用启衡星qubit试剂盒,性能优越,稳定),我们就可以将质粒梯度稀释得到一组标准品。 

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质粒标准品拷贝数的计算及稀释方法

拷贝数的计算

1OD260=50ng/μL双链DNA,待测样本浓度(ng/μL)= OD260×50(×稀释倍数)

1μL双链DNA标准品物质的量(mol)=(稀释倍数×OD数×50×10-9)/(序列长度×649)

1μL双链DNA标准品的数量(copies)=(稀释倍数×OD数×3×1016)/(序列长度×649)

质粒标准品倍比梯度稀释方法:

1V原液(标准品Ⅰ)+ 9V稀释缓冲液,得标准品Ⅱ

1V标准品Ⅱ+ 9V稀释缓冲液,得标准品Ⅲ

1V标准品Ⅲ+ 9V稀释缓冲液,得标准品Ⅳ

1V标准品Ⅳ+ 9V稀释缓冲液,得标准品Ⅴ

绝对定量实验例-拟南芥中A基因的绝对定量

试剂:启衡星SYBR Green qPCR Mix

标准品:质粒标准品设置5个浓度梯度,分别3个重复;并设置阴性对照;

实验步骤:设计A基因qPCR特异性引物

          提取拟南芥基因组DNA

          荧光定量PCR 扩增实验

          结果分析,计算得出拟南芥样品中A基因的copy数。

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标准曲线制作:利用Mean Ct 作图可得到标准曲线

y = -3.481x + 40.123   R2 = 0.9996


扩增效率(E)计算

E =10-1/斜率-1

=10-1/-3.481 -1

=1.983-1

=0.938

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相关系数(R2):大于0.98,越接近1,结果可信度越高。

扩增效率(E):0.8-1.2, 越接近1,越理想。 

标准差STD一般要求小于0.5,在比较严格的实验中,要求小于0.2。  

样品中A基因的拷贝数计算:

将Ct值带入线性方程:

18.45= -3.481 X +40.123中,即可计算出未知样品的拷贝数;

将Ct值带入线性方程:

18.45= -3.481 X +40.123

6.png

相对定量

比较两个或两个以上样本中、或处理组与对照组某个基因表达量的变化

适用于您只关注样本间基因表达量的差异,不关心某基因的绝对表达量;

同样,对于相对定量,我们也需要关注几个因素:

一个参照样本

一个或一个以上的未知样本

目的基因

一到两个管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量(对于管家基因的选择我们上上期的内容-实验室设计中已经给大家分享,大家可以翻阅我们前期的内容进行查阅)

重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。

标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可

实验结果显示——扩增曲线;标准曲线(有些分析方法不需要);融解曲线(探针法不需要)

标准样本(有些分析方法不需要)

对于相对定量,最常用的有两种方法:


(1)双标准曲线法

通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行绝对定量,然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

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双标准曲线法实验例-盐处理油菜中A基因的相对定量

试剂:启衡星SYBR Green qPCR Mix

标准品:质粒标准品设置5个浓度梯度,分别3个生物学重复;每个样品同样设置3个生物学重复,并设置阴性对照;

实验步骤:设计A基因qPCR特异性引物

          提取处理组、对照组的RNA,并反转录为cDNA

          荧光定量PCR 扩增实验

          结果分析,计算出待测样品1和2与对照组相比目的基因A的表达量是上升了,还是下降了?

实验数据

检测样品

目的基因A

管家基因H

定量结果

定量结果

校正值

相对量

对照样品

1234

5678

0.217

1.000

待测样品1

1124

5578

0.201

0.926

待测样品2

1089

5789

0.188

0.866

从定量结果可以看出,待测样品1和2相对于对照样品在目的基因A的表达量上有所下降。

总结:

双标准曲线法优点:数据最准确,不用考虑扩增效率不好的影响;分析简单,实验优化相对简单

双标准曲线法缺点:对每一个基因,每一轮实验都必需做标准曲线

应用:基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一


(二)相对定量分析--2-△△Ct法

公式

8.png

2-△△Ct法实验例--胁迫处理后,油菜中A基因的相对定量

Sample

目的基因

(Mean Ct)

GAPDH

(Mean Ct)

E

处理前

15

13

1.95

处理后

18

20

1.95

2 - △△Ct法:假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%

△Ct(处理前)=15-13=2     △Ct(处理后)=18-20=-2

△△Ct=△Ct(处理后)-△Ct(处理前)=-2-2=-4

比率(处理后/处理前)=2-△△Ct=2-(-4) =16

所以目的基因在处理后表达水平是处理前的16倍

小结

优点:无需作标准曲线,实验流程相对简单;

缺点:

            假定扩增效率为 100 %;

            假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致;

            实验条件优化较为复杂。

因此采用此方法进行计算分析,再我们不知道扩增效率的时候,我们得到的结果可能会与实际结果有很大偏差。但是它也可以通过做标准曲线,看扩增效率进行校正,因此在实际操作的时候,推荐大家做一下标准曲线,看实际的扩增效率然后进行结果的校正,确保更准确的结果。

修正方法:如果我们知道目的基因和参照基因有相同的扩增效率,但扩增效率不等于2,那么2-△△Ct可以修正为:E-△△Ct,例如扩增效率为1.95,那么计算公式可修正为

1.95-△△Ct

2-△△Ct法是基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

了解完qPCR的分析方法之后,是不是思路清晰多了呢,期待您有好的收获,本期的内容就到此结束啦,记得关注我们哦,更多精彩内容,敬请期待!