俗话说的好，“好的开始是成功的一半”，但是我们还有一句话叫做“万事开头难”，而这话在RT-PCR中则体现的淋漓尽致。第一步——如何将RNA高效地反转为cDNA，表面上看似简单，实际上则处处是陷阱，一不留神就会让斗志高昂的实验大咖们摔的鼻青脸肿，而且还不知道是咋掉坑的。显然，将RNA高效反转录成cDNA可不是那么简单哦，今天就给大家分享反转录实验中的一些Tips。

首先，反转录之前，我们需要思考的一些问题：

• 样本中RNA的浓度、纯度和完整性是否达到反转录的要求？

• 加入多少量的RNA进行反转录？

• 如何解决基因组DNA污染的问题？

• 我们所定量的目的基因的GC含量如何，高GC含量的基因如何有效的扩增？

• 我们所想要反转录的目的基因中，RNA是否含有二级结构？如果有二级结构，如何去除二级结构？

• 反转录的引物如何选择？

• 操作过程中需要注意哪些细节？

RNA浓度、纯度和完整性

　　在上一期的“qPCR实验中核酸的提取及质控”软文中，有关RNA的浓度、纯度和完整性等方面的内容我们做了详细的介绍，大家可以回顾我们上一期的内容。RNA的纯度及完整性不仅影响了反转录的效率，同时决定着定量实验的准确与否。首先，RNA样品中盐、金属离子、乙醇和苯酚残留，会抑制cDNA合成反应效率。因此，在含有杂质的RNA样品中，进行RNA的纯化是非常有必要的；其次，RNA的完整性也是非常重要的一个因素，决定了我们反转录的策略。例如，对于生物来说，我们通常用Oligo dT进行反转录实验，这对于完整性好的RNA（RIN > 7）通常是可行的，但是对于有降解的RNA来说，反转录得到的都是3’端的序列，5’端或中间的片段都没有得到有效的反转录，如果我们引物设定的位置靠5’端或中间位置，很显然得到的结果要比实际上小很多；再次，对于基因全长反转录来说，完整RNA的是必须的；最后，同一个实验中，不同组中RNA的完整性需要保证在同一水平上才能确保得到准确的定量结果。

RNA反转的起始量

　　反转录中RNA的起始量可以从ng到几μg，可以根据实验的实际情况进行调整，当然首先需要遵循的原则是相同起始量原则，不同样本间应用相同的RNA量进行反转录，减少系统的误差。另外，对于检测低丰度表达的基因来说，可以适当增加反转录的RNA起始量；最后，应当遵循所用试剂盒推荐的RNA用量范围，太低或者太高都会有影响反转录的效率（图1）。

图一，起始RNA模板量对反转录效率的影响

基因组DNA污染问题

　　对于含有基因组DNA污染的样品，可以用DNase Ⅰ处理样本，以除去样品中残留的DNA。当今市面上成品的反转录试剂盒，大多数都会含有除基因组DNA的组份，因此，对于这个问题通常都很好解决。

高GC含量的基因反转录

　　对于高GC含量的目的基因反转录实验，可能是让我们头疼的问题，一般的酶对于这些高GC片段基因的反转录效率通常都比较低，现在市面上已有一些酶经过基因工程改造之后，可以耐受较高的温度，同时对高GC片段也有较好的反转录效率。因此，对于这样的实验，可以选择相对应的试剂盒；另外，针对这些高GC基因的反转录实验，可以预先65℃处理5min，随后加入反转录酶进行cDNA的合成，可以提高反转录的效率。

RNA二级结构

　　RNA的二级结构是阻碍cDNA有效合成的因素之一（图二），对于某一特定RT-qPCR实验来说，我们最好能够知道我们检测的某个基因，它的RNA是否含有二级结构，进而决定我们在反转录实验的策略。这里给大家推荐一款网页版的RNA二级结构预测软件—Mfold（图三），让大家更直观的了解我们所检测的基因的RNA情况。

图二，复杂模板中二级机构阻碍合成

 图三，RNA二级结构预测软件

　　那么针对于含有二级结构的RNA模板，我们通常可以有三种策略来提高反转录效率。

　　一、用Oligo dT和随机引物混合进行反转，这样可以提高RNA的反转录效率，缺点是不能得到很长的cDNA（如图四），但对于qPCR来说影响不是很大。

图四，Oligo dT、Random Primer混合使用提高反转录效率

　　二、高温条件下进行反转录（图五），利用高温把二级结构打开，优点是可以提高二级结构RNA的反转录效率，同时得到较长的cDNA。缺点是对酶的热稳定性要求很高，会损失酶的反转录效率，一般的酶在高温下很容易失活，另外这种条件下有些二级结构不能完全的打开。 

图五，高温条件下进行反转录

　　三、两步法进行反转录（如图六），先高温孵育，打开RNA二级结构，再加入反转录酶进行反转录反应。这样的好处是可以完全打开RNA的二级结构，提高反转录效率，另外不影响反转录酶的活性。缺点是操作上稍微繁琐一些。

图六，两步法反转录示意图

引物的选择

　　随机引物，多用于原核生物的RNA反转录，另外在真核生物中也被用到，尤其在复杂模板或降解模板中RNA的反转录实验中被用到。但是它能以rRNA为模板合成cDNA，具有拷贝数被高估的风险。

　　Oligo dT，真核生物的反转录实验被用到（RNA含有Poly-A尾），特异性优于随机引物，但是受复杂结构影响较大，降解模板影响也大。

　　Oligo dT和随机引物混合使用，受复杂结构影响较小，弥补由于酶的合成长度限制，导致某些距Poly-A较远的片段用Oligo dT合成效率低的情况，通常可以1：1混合使用。

　　基因特异性引物，cDNA合成的特异性最好，qPCR的首选。

实验操作注意细节

　　RNA会被RNaseA降解，RNaseA 又无处不在，所以在提取RNA及反转录时，需避免核糖核酸酶的污染。

避免RNase污染的一般建议

因DEPC是一种强烈的RNase抑制剂，所以在RNA提取及反转录实验时，需用DEPC处理用于cDNA合成的所有管和移液器吸头或使用经过认证的无核酸酶实验室器具。

处理RNA和所有试剂时需戴上手套，因为皮肤是RNases的常见来源。 并需经常更换手套。 

使用不含RNase的试剂，包括无RNase 的超纯水。

使用RNase Inhibitor（随试剂盒提供）保护RNA免受RNases的影响。

在逆转录反应时，应保持所有管密闭；在不做实验时，应保证所有反转录试剂密封保存在-20℃。